Victor Borrien

“ VII. — Le réactif de Denigès peut être utilisé pour la recherche de l'hydrobilirubine, dans les matières fécales, aussi bien que dans les urines, et la technique à suivre est la même. Mais j'ai montré pourquoi il était nécessaire d'employer l'alcool amylique pour séparer le pigment libéré ; celui-ci en effet ayant plus d'affinité pour la solution aqueuse acide, le chloroforme ne peut le dissoudre qu'en faible quantité. L'alcool amylique, au contraire, en se saturant d'acide, dissout entièrement le pigment. ”

“ Le sulfate acide de mercure (réactif de Denigès) ne précipite pas l'urobiline ; il peut se faire qu'il y ait une faible quantité de pigment entraîné par le précipité qui se forme dans la défécation, mais ceci n'empêche nullement d'obtenir la réaction décrite par M. Grimbert, car il reste suffisamment d'urobiline dans la liqueur filtrée, pour provoquer la fluorescence. Je partage plutôt l'opinion de l'auteur, qui affirme que ce procédé est très utile pour retrouver des traces d'urobiline, quand on se trouve en présence d'autres pigments, et, c'est le cas de l'urine, ou des matières fécales. ”

“ A mon avis, le valérianate de zinc ne peut donner une fluorescence plus remarquable que celle qui est obtenue avec l'acétate de zinc, admis généralement par tous les laboratoires d'analyses (réactif de Roman et Delluc) .
Je répète, ce que j'ai dit précédemment au sujet de la fluorescence, à savoir : que tous les sels de zinc peuvent la provoquer avec la même intensité, s'ils sont employés dans des conditions favorables. Ceci dit, pour éviter d'augmenter à l'infini, le nombre des réactifs basés sur la même action chimique ”

“ L'intestin de l'adulte, fonctionnant normalement, ne doit éliminer que des pigments réduits, dont l'hydrobilirubine forme le terme principal. La modification du pigment s'opère par des phénomènes de réduction.
Théoriquement, on explique cette transformation par réduction et hydratation de la bilirubine.
Il peut y avoir aussi, d'abord formation de biliverdine par oxydation de la bilirubine et ensuite formation d'hydrobilirubine, par réduction de la biliverdine formée; c'est là une hypothèse que l'on peut concevoir comme la précédente. ”

“ Hydrobilirubine. — L'hydrobilirubine fut trouvée par Vanlair et Masius (i) qui la retirèrent des matières fécales, en les traitant par l'alcool et l'acide sulfurique ; elle était isolée ensuite au moyen du chloroforme. Ils lui donnèrent le nom de stercobiline et longtemps elle fut considérée comme très différente de l'urohiline découverte dans l'urine par Jaffé (1868) , trois années auparavant. Mac Munn (2) , le premier, admit que ces deux substances étaient très voisines ; on assimila l'hydrobilirubine à l'urobiline fébrile. ”

“ Je crois devoir apporter aussi une rectification au sujet de
l'interprétation de la réaction de M. Triboulet, donnée par M. Cawadias (2) tout récemment. D'après cet auteur, M. Triboulet dirait : réaction rose, pigment hépatique normal, hydrobilirubine; réaction verte, évacuation trop rapide, absence de processus de réduction, « si la réaction est jaune, nous sommes en présence de stercobiline, c'est-àdire d'un pigment modifié défavorablement et produit par un foie qui fonctionne mal ». ”

“ Le spectre à deux bandes pourrait alors s'expliquer par la présence de ce pigment intermédiaire.
Maintenant, la vie chez l'adulte étant très active, il est à supposer que cette modification ne représente qu'un temps très court ; c'est pourquoi aussi l'hématoporphyrine serait généralement absente dans la bile et toujours dans les matières fécales. Cette question demanderait donc à être approfondie et certainement que l'étude du spectre à deux bandes, faite parallèlement avec la détermination chimique de l'hématoporphyrine dans la bile, serait des plus intéressantes. ”

“ En effet, cette réaction de l'hydrobilirubine qui est d'une très grande sensibilité, demande, quel que soit du reste le dissolvant de l'hydrobilirubine, à être faite en milieu neutre ou très faiblement acide. Lorsque l'on emploie le chloroforme comme dissolvant et que l'on recherche la fluorescence par le réactif alcoolique à l'acétate de zinc au millième, on doit s'assurer que la solution chloroformique est parfaitement indemne d'eau, ainsi que le tube qui servira
à la réaction, la moindre trace de celle-ci pouvant empêcher la fluorescence, sinon l'atténuer fortement. ”

“ Quelquefois la coloration est brunâtre; on ajoute alors 1 ou II gouttes d'eau oxygénée à io volumes, on porte à nouveau au bain-marie et la coloration bleue ou verte apparaît.
L'addition de la solution de sulfate d'ammoniaque à l'extrait aqueux a pour but de donner naissance à un précipité de sulfate barytique, lorsque l'on ajoute le chlorure de baryum. Le précipité de sulfate de baryum, plus dense que le précipité formé par le pigment, entraîne celui-ci et permet de le séparer plus complètement. ”

“ Heinsius et Campbell soutinrent cette théorie, défendue également par Stokvis. Mais Liebermann démontra facilement que la différence entre les deux pigments existait bien, puisqu'il parvenait à obtenir de l'urobiline en partant de la cholétéline. Si l'identité avait été établie d'une façon indiscutable, elle aurait eu pour conséquence cette particularité intéressante : c'est qu'en partant de la bilirubine, on pouvait arriver à l'hydrobilirubine, par des phénomènes d'oxydation ; tandis qu'il est démontré que c'est par des processus de réduction qu'on y parvient. ”

“ Les méthodes de recherches qualitatives de l'hydrobilirubine sont donc, comme on le voit, peu nombreuses; elles se ramènent invariablement à deux opérations : examen de la bande d'absorption, fluorescence sous l'action des sels de zinc; ce sont du reste les seuls moyens connus jusqu'à présent. La fluorescence est certainement le plus sensible des deux, car elle apparaît souvent encore, quand la bande n'est plus visible au spectroscope. ”

“ Elle peut facilement être mise en liberté par les acides ; elle devient alors soluble dans le chloroforme, assez soluble dans le sulfure de carbone et l'alcool amylique, mais peu soluble dans l'alcool éthylique. On a pu l'obtenir cristallisée, sous forme de tablettes rhombiques, avec des angles obtus, souvent arrondis.
Les radiations du spectre sont entièrement absorbées par ses solutions et l'absorption croît régulièrement du rouge vers le violet. Elle est peu abondante dans la bile, mais son pouvoir colorant est extrêmement puissant. ”

“ La solution d'hydrobilirubine dans l'alcool amylique étant versée dans la burette graduée, on la laisse tomber goutte à goutte dans le réactif, jusqu'à disparition du louche, en ayant soin d'arrêter l'écoulement au moment précis où le liquide s'éclaircit, indice de l'apparition de la fluorescence.
Le titrage du réactif révélateur s'obtient avec une solution étalon d'hydrobilirubine du commerce (en l'espèce l'auteur a utilisé l'urobiline de Merck) . Là, précisément, comme M. Descomps l'a fait remarquer, on ne peut avoir de sécurité abolue, sur la valeur exacte de la solution titrée. ”

“ On épuise par plusieurs traitements, une petite quantité de matières fécales, avec de l'éther de pétrole, de manière à enlever le maximum de graisses et de chromogène. La solution est évaporée très rapidement au bain-marie ; elle laisse un résidu jaune verdâtre, souillé par des impuretés. Celui-ci est repris par de l'alcool faible, acidulé avec une goutte d'acide azotique. La solution alcoolique, filtrée et évaporée à nouveau, laisse bientôt apparaître l'hydrobilirubine, qui se forme par oxydation rapide. Le résidu repris comme précédemment, par l'éther de pétrole, est complètement insoluble. ”

“ La solution alcoolique obtenue est fluorescente, et, si on l'examine au spectroscope, elle présente la bande caractéristique de l'hydrobilirubine.
Dans cette réaction, l'acétate de zinc en excès paraît oxyder le chromogène.
Pour obtenir un effet sur toute la masse pigmentaire, on peut employer l'alcool faiblement acidulé avec l'acide chlorhydrique, par exemple à 2. p. 1.000; on décompose ainsi les hydrobilirubinates et cette très faible acidité ne gêne pas pour avoir la fluorescence. ”

“ Méthode de Chauffard et Rendu (2) . - La technique suivie par MM. Chauffard et Rendu est exactement celle qui a été donnée précédemment par M. Grimbert (3) pour les urines. Les auteurs font un extrait aqueux des matières fécales, qu'ils traitent par le réactif de Denigès (réactif au sulfate acide de mercure) . ”

“ L'hydrobilirubine est un produit mal défini, qui n'a pas encore été isolé à l'état de pureté absolue. Sa constitution chimique, bien qu'on ait doté ce pigment d'une formule, est encore à établir. Si donc, l'on considère ce principe de la méthode comme exact, il faut, toutefois, faire des réserves sur la garantie offerte par le dosage effectué dans ces conditions. ”

“ On fait chauffer quelques minutes et on filtre; le résidu est repris plusieurs fois de la même façon. Les liqueurs barytiques sont mélangées et l'excès de baryum est ensuite précipité par une solution concentrée de sulfate de soude, on filtre à nouveau jusqu'à ce que la solution soit devenue claire. Le filtrat est acidifié faiblement avec de l'acide sulfurique et l'hydrobilirubine est précipitée par l'addition d'un excès de sulfate d'ammoniaque pulvérisé, on laisse en contact pendant vingt-quatre heures. ”

“ Du reste M. Winter (2) attribue à son pigment rouge brun des propriétés bien peu différentes de celles de l'hydrobilirubine: insolubilité partielle dans l'eau, faible décoloration en présence des agents réducteurs (hydrogène naissant) , il ne donne pas la réaction de Gmelin.
J'ai essayé d'obtenir cette bilirubidine par différents procédés d'oxydation, tant sur l'hydrobilirubine que sur les pigments primitifs, mais sans succès. J'ai laissé très longtemps au contact del'air, dans une capsule de porcelaine, des quantités notables d'hydrobilirubine, provenant déjà de l'oxydation du chromogène. ”

“ Ce phénomène se poursuit plus loin dans l'organisme; et, tout ce qui reste du pigment réduit, non absorbé, est évacué avec les selles, soit à l'état de chromogène, qui forme comme nous le savons la part la plus importante, soit à l'état d'hydrobilirubinates alcalins. ”

“ Seulement, j'estime qu'il serait préférable d'opérer sur des extraits aqueux, obtenus par une longue centrifugation.
plutôt que sur les selles elles-mêmes. On éliminerait ainsi, de nombreuses causes d'erreur, fournies par les résidus et les substances étrangères, qui peuvent donner : soit une coloration spéciale, soit une atténuation à la coloration produite par le pigment biliaire.
Lorsque l'on a affaire à des extraits aqueux, contenant du pigment biliaire non réduit, (biliverdine ou biliverdinates) , on remarque que la précipitation des matières albuminoïdes est beaucoup plus importante. ”

“ La bile humaine, examinée au spectroscope, ne présente pas de bandes d'absorption caractéristiques ; cependant Mac Munn (2) signale comme particularité, quatre bandes d'absorption dans la bile du bœuf et du mouton, il les attribue à la présence de \& cholohématine.
La cholohématine a été isolée par Mac Munn en agitant, avec du chloroforme, la bile de bœuf ou de mouton débarrassée du mucus. L'extrait chloroformique laissait, après évaporation, un résidu de couleur verte, soluble dans l'alcool. ”

“ En dehors de la bilirubine et de la biliverdine, on cite encore les pigments suivants : la bilifuscine, la biliprasine, la bilicyanine ou cholécyanine et la cholétéline. C'est Staedler (i) , qui le premier apporta un peu d'ordre dans la description de ces matières colorantes de la bile, encore peu connues jusqu'à lui.
La bilifuscine. — (G32H40Az4O8) découverte par Staedler (2) , est un pigment bien peu étudié. Il résulterait de l'hydratation de la bilirubine. Son caractère principal, serait de ne pas donner la réaction de Gmelin. ”

“ D'après Nencki et Rotschy (i) , ses solutions dans l'acide acétique, donnent au bout de peu de temps des cristaux brun rouge, rappelant l'hématoïdine.
Les solutions d'hématoporphyrine obtenue de l'urine, par la méthode de Garrod (précipitation par la lessive de soude) , possèdent une belle couleur rouge, avec un reflet bleu.
Les solutions faibles rappellent la couleur d'une solution très diluée de permanganate de potasse, les solutions plus fortes sont rouge pourpre ou rouge cerise. ”

“ La différence entre les deux réactions, c'est que le réactif de M. Triboulet, par son acidité, retient de l'hydrobilirubine en solution, tandis qu'à la longue, dans la réaction de Schmidt, le pigment précipite complètement à l'état de combinaison insoluble. On assiste à cette précipitation lente du pigment, qui donne une combinaison si tenue, qu'on ne peut la séparer complètement par centrifugation, ni par filtration ”

“ L'hydrobilirubine, c'estune chose certaine, est complètementinsolubledans l'éther de pétrole ; mais'elle peutacquérir la propriété de s'y dissoudre, tout au moins partiellement, quand elle s'obtient par oxydation du chromogène en présence de graisses. Quant au chromogène, lui-même, il se dissout en totalité dans l'éther de pétrole, avec la même facilité que les matières grasses. J'en ai eu la preuve de la façon suivante : soit un extrait chloroformé de selles, à la fois très riches en chromogène et en graisses ”

“ L'alcool dissolvait donc une substance, insoluble dans l'eau, capable de donner une réaction assez comparable à celle du sang.
Voici maintenant comment j'obtiens le pigment, que, d'après ses caractères, j'ai identifié à de l'hématoporphyrine : Le méconium est longuement trituré dans un verre à expérience avec de l'acétone. Si la dilution est suffisamment concentrée, on remarque, après filtration, que le liquide jaune ambré obtenu accuse au spectroscope deux bandes: l'une a plus étroite est située près de D ”