Joseph Galimard

“ Get auteur constata que ces microbes produisent des ferments (cest-à-dire des corps albuminoïdes) dans un milieu dépourvu d’albumine.
Jusqu’ici, en fait de microbes pathogènes, il n’y a que le Bacille pyocyanique qui ait donné des résultats positifs, les autres ont des exigences plus grandes que les microbes non pathogènes, car nous voyons les mi-crobes de Winogradsky, par exemple, pousser très bien dans des milieux purement minéraux (LACOMME) (56) . ”

“ Tèls sont les différents problèmes que nous nous sommes posés : le travail que nous présentons aujourd’hui est très incomplet, il ne fait qu’esquisser quelques grandes lignes, mais nous pensons que c’est dans cette voie qu’il faut chercher l’étude des secrétions chimiques microbiennes, et s’il peut servir à quelques cherçheurs, notre but sera atteint. ”

“ On alcalinise avec de la baryte pulvérisée et on essore, la liqueur contient la lysine, le prëcipité contient Farginine et l’bistidine à l’état de combinaisons argenti-q.ues insolubles en présence d’un excès de baryte. Après reprise par S04H 2, on traite par H2S qui décompose tous ces sels d’argent et met les acides diaminés en liberté. ”

“ Au liquide filtré, jaune clair, on ajoute de l’acidé sulfurique pur et étendu jusqu’à précipitation compiète de toute la baryte libre ou combinée, ce qui est indispensable, le baryum étant nuisible aux microbes; il vaut donc mieux ajouter un petit excès d’acide sulfurique (facile à saturer plus tard avec des sels de sodium ou de potassium) que de laisser du baryum On filtre pour séparer le sulfate de baryum ; on lav.e le précipité. Tous les liquides ob-tenus sont évaporés dans le vide à 40-45°. L eau qui distille renferme un peu d’acide acétique, ce qui n’a pour nous aucun intérêt. ”

“ Pour nos milieux de culture, nous transformons le picrate en cblbThydrate. Pour cela, le picrate de lysine est dissous dans l’eau et additionné de 5% d’acide chlorhydrique, l’acide picrique libre est enlevé par l’éther à 65°; après trois ou quatre reprises, l’éther ne se colore plus, la liqueur aqueusè contient la lysine à l’état de chlorhydrate mélangé d’acide chlorhydrique libre, on lâ décolore par le noir de sang, on filtre et on évapore à siccité, on reprend par l’eau et on fait cristalliser d^ns le vide sur l’acide sulfurique et la potasse ”

“ L’hypothèse suivante nous est venue à l’esprit; les toxines microbiennes sont-elles bien albuminoïdes? Ne seraient-ce pas plutôt des bases analogues à la choline mais plus toxiques que celle-ci, analogues àla névrine, à la muscarine? C’est dans cette voie que nous orientons nos Techerches actuelles.
Virulence de nos bouillons de culture.
Nous avons voulu voir si les microbes perdaient leur virulence après passage dans nos milieux aminés. ”

“ Les eaux mères de ce précipité floconneux saturées d’acide phosphotungstique donnent un prêcipité gra-nuleux cristallin qui est traité comme le précédent par la baryte et l’acide carbonique; HUGOUNENQ et MOREL traitèrent alors le résidu, suivant la méthode de KOSSEL et KUTSCHER (52) pour la recherche des acides diaminés, par le sulfate d’argent et la baryte, ils obtinrent un précipité argentique qui, faible, leur donnèrent des traces douteuses d’histidine ”

“ On traite la liqueur par l’acide pbospbotungstique quiprécipite les diamines et laisse l’urée et des impuretés. On décompose ie précipité par la baryte, et après traitements successifs par l’eau et l’acide carbonique on obtient une masse jaune pateuse qui, reprise par l’alcool absolu et l’acide picrique, laisse déposer du picrate de lysine insoluble dans l’alcool absolu ”

“ Le bacille pyocyanique a donné des cultures positives avec tous les acides aminés donnés (sauf avec la phényl-alanine) et nous avons obtenusune série de générations en glycocolle,.tyrosine, arginine, urée, etc. ”

“ Lës diamines étant séparées par l’acide phosphotungstique, les monamines restent dans la solution chargée d’un excès d’acides, phosphotungstique et sulfurique, on sature par l’eau de baryte et la baryte pulvérisée, on essore, pn lave à l’eau bouillante en . excès afin de dissoüdre l’aspartate de baryte peu soluble, on enlève l’exeès de baryte par l’acide carbonique, on filtre et on évapore.
On concentre jusqu’à apparition d’une croûte cristalline, par refroidissement la màjeure partie de la tyrasine précipite. ”

“ D’après cet auteur la plupart des bacilles, sauf le bacille d’Eberth et celui de la tuberculose, poussent dans son milieu. II conclut que les microbes pathogè-nes peuvent être cultivés dans des milieux pincs d’albumine ; qu’ils y restent virulents et capables de fabriquer des toxinés ; que celles-ci appartiennent à la classe des corps protéiques (albumoses ou peptones) ; que les microbes les forment par syntbèse, qu elles sont élaborées dans le corps meme des bactéries et qu’elles ne résultent pas de la décomposition du müieu nutritif. ”

“ En résumé, les glucoprotéines a de SCHUTZENBERGER, comme celles de LEPIERRE, ne sont pas des corps chimi-quement définis mais des mélanges d’acides aminés ; les albumines s’hydrolysent par les alcalis comme par les acides, sauf quelques particularités, tellesque la destruc-tion par la baryte de l’arginine, stable en milieu acide ; les dénominations leucéines sï de glucoprotéines doi-\ent donc disparaître du langage scientifique (44) . ”

“ Le chlorhydrate d’éthylglycocolle est agitéavecde l’eau tenant en suspension de l’oxyde d’argent ou de l’oxyde de plomb fraî-chement précipités, il se forme du chlorure d’argent ou du cblorure de plomb, on sépare, on fait passer H2S dans la liqueur, filtre, porte à l’ébullition. L’éther est alors saponifié soit par la baryte, soit par l’eau, on reCueille le glycocolle à l’état libre ou
Sljcoc°fiste de baryum que l’on peut facilement décomposer par la quantité théorique d’acide sulfurique,
A lanine. ”

“ G’est un corps blanc en aiguilles soyeuses, solubles dans Feau bouillante; peu sôlubles dans Feau froide, (1/1900) , se combinant avec les acides, mais plus faci-lement avec les bases, à cause de ses fonctions phénoli-que et acide.
La tyrosine donne la réaction de Millon. Traitant par l’acide sulfurique concentré addiüonné d’un peu d’acide fumant, saturant à rébullition par le carbonate de baryte, on obtient une colora|ion violette par le perchlorure de fer,comme d’ailleurs avec beaucoup de phénols (PIRIA) . ”

“ Si l’on remplace la tyro-sine par de la lysine, la quantité .de pyocyanine formée est encore plus élevée.
En dehors de cé pigment bien connu nous avons recueilli et isolé de petites quantités d’albumine ou plu-tôt de matières protéiques, ayant une teneur en azote variant de 10 à 12 %, donnant les réactions de Millon et de biuret ne contenant pas de phosphore mais conte-nant du -soufre. Par l’éther, nous avons enlevé une matière grasse difficilement saponifiable, contenant de l’acide glycérophosphorique et ayant les allures des lécithines. ”

“ Le réactif phosphotungstique, que nous employons, a la for-mule suivante :
Acide phosphotungstique . 250 gr.
Acide sulfurique 50 gr.
Eau distillée q. s. pour 1000 cmc.
On obtient ainsi une première séparation; d’un côté : l’argi-nine, l’histidine, lalysine, l’acide aô diaminovalérique, lacystine, à l’état de phosphotungstates insolubles; de l’autre : la leucine, la tyrosine, les acides glutamique et aspartique, le glycocolle,
1 alanine, la phénylalanine, la sérine, la valine, la proline, à l’état de phosphotungstates solubles.
a) PIIOSPHOTUNGSTATES INSOLUBLES (diamines) . ”

“ On continue à évapbrer tant qu’il se précipite des cristaux donnant la réaction de Millon, ceux-ci sont composés de lyrosine et de leucine. On les réunit aux précédents et on les dissout
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dans l’eau cliargée de 10 % de soude causüque, ôn chauffe à 80° ét on filtre, on acidifie par l’acide acétique, par refroidissement la tyrosine cristallise. Les eaux mères sont jointes à la liqueur primitive contenant les autres monamines. On concentre un peu pour avoir une liqueur sirupeuse.
On faitpasser un courant d’HGl gazeux jusqu’à refus, on re-froidit à — 5° et après huit jours de. ”

“ On centrifuge, décahte et on ajoute de 1 alcool à 93° qui dissout le précipité, on le reprécipite, par l’éther anhydre. II se dépose un précipité flocomeux qui lavé à féther et séché pèse 0 gr. 0524, il est très soluble dans les alcalis, le chlorure de sodium, les aci-des faibles, insoluble dans les acides concentrés ; lare-cherche de 1 azote est positive, il brûle entièrement sans résidu, il donne la réaction de Millon, maisje n’ai pu obtenir lebiuret. II ne donne pas la réaction de Weidel, mais chaufté avec KOH il laisse dégager une 'odeur de choline. ”

“ L’bistidine se présente sous la forme d’aiguilles et de tables, de réaction alcaline ; elle estsolûble dans l’eau, peu dans l’alcool, insoluble dans l’éther.
Le ‘ cblorhydrate d’histidine C6H9N302HC1 --f- H 20 se présente sous la forme de tables rhombiques, assez facilement solubles dans l’eau, insolubles dans 1 alcool et l’éther ; lorsqu’on le dissout dans un peu d’HCl chaud et concentré et qu’on le précipite par de ralcool éthéré, qu’on recommence plusieurs fois ce traitement, on obtient un bicblorhydrate C6H9N302.2 HCl cristallisant en grandes tables fusibles à 231-233°. ”

“ Gorps homologue supérieur du glycocolle, que l’on rencontre avec lui dans Fhydrolyse des matières alhu-minoïdes. Ingérée, ellc produit chez le hipin, une augmentation considérable dans la proportion d’urée excrétée, mais SALKOWSKI a remarqué qu’une partie de l’alanine était éliminée en nature (73) . D’après GAGLIO, ralaninc exercerait une action déprimante sur le cer-veau et la moelle allongée de la grenouille. Chez les pigeons la dose toxique serait de I gr. On constate une paralysie spinale et la mort survient avec un ahaisse-ment considérable de la température. ”

“ Acide aspartique. — La purification de l’acide aspartique est basee sur ie peu de solubilité de son sel de baryum. S’il est melangé de sérine, il faut le traiter par l’éther de pétrole qui dissous la sérine et laisse les autres acides aminés.
Tyrosine. Nous avons déjà parlé de la purification de la tyrosine a propos de son extraction (p. 38) et à propos de la leu-•cine (p. 43) .
PROPRIÉTÉS DE QUELQUES ACIDES AMINÉS ( 1)
§ 1. Arginine. ”

“ LËS DILEUCÉINES D ont été dissociées en :
1° Polypeptides dédoublables, par l’hydrolyse acide prolongée,en lysine, alanine, proline, acide aspartique, acide glutamique ;
2° Diamines : lysine et ornithine;
3° Monamines : alanine, leucine, proline, phénylala-nine, acide aspartique, acide glutamique et traces de tyrosine.
Comme on le voit, les prétendues glucoprotéines ne
WBÊÊÊÊBÊ
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sont pas « des espèces chimiques bien définies » comme le dit LEPIERRE, mais des mélanges d’acides monoaminés, incomplètement débarrassés d'ïmpüretés non cristal-lisables. ”

“ La question des milieux de culture chimiquement « définis, d’un si haut intéret en bactériologie, a son « origine dans les recherches des biolôgistes, qui, avant « la découverte des microbes, avaient étudié le déve-« loppement des organismes inférieurs clans un milieu « artificiel formé d’élément chimiquement clétinis. » ”

“ Nous avons employé plusieurs sortes de ïiquictes nutritifs, les uns ne renfermant que des acides aminés comme matière organique, les autres renfermant en plus de la glycérine. Comme il fallaiC s’y attendre, les milieux où n’entre pas de glycérine sônt moins nutritifs que les autres.
Primitivement, nous avons employé le sucre, mais quelques essais faits avec cet hydrocarbone et la leucine, comme corps azoté, ont été abandonnés ; la stérilisation n’a pu ôtre complète à 100° meme emla répétant trois jours de suite; à une température plus élevée, il y avait commencement de caramélisation. ”

“ Nous nous sommes toujours assurés que les cultures étaient bien positives, réensemençant nos premières cultures, car on aurait pu jusqu’à un certain point, nous objecter qüe le trouble obtenu en première générà-tion était dû aux grumeaux ayant servi à l’ensemencement et qui se seraient dissociés, de plus, l’examen microscopique a toujours été fait pour nous assurer que nous n’avions pas de contamination. ”

“ Cependant Fbydrolyse barytique à-J-100° semble plus ménagée ; les acides diaminés ne peuvent être comparés, car Farginine est décomposée en urée et acide diamino-valérique etla lysine subit aussi une attaque partielle et dédouble samolécule.
Nous venons de voir ce que sont les glucoprotéines de SCHUTZENBERGER, d’après les derniers travaux parus; celles de LERIERRE ne sont pas identiques et ne sont pas constituées de la meme façon. ”

“ La leucinë est très répandue ckez les etres vivants; à l’état physiologique, on Fa trouvée dans la râte, le pancréas, lèg ganglions lymphatiques, les glandés sali-vairesv et à l’état pathologique dans le foie des leuco-cythémiques, des varioleux, des typhiques. ”

“ Quant à cultiver les microbes dans de tels milieux, glucoprotéines ou leucéines, cela revient en fait à les cultiver dans des solutions oü entrent des mélanges d’acides aminés plus ou moins impurs. C’est Fétude de ces acides aminés retirés des albuminoïdes que nous allons voir maintenant. ”

“ On chauffe une partie de ces albuminoïdes, calculés secs, avec 2,5 à 3 p. de baryte bydratée pure et 4 p. d’eau-. On cbautfe le tout dans de grands ballons, en communication avec des réfrigé-rants ascendants, d’abord au bain-marie, jusqua fluidmcation complète des produits, puis on chauffe à feu direct à la tempera-ture de rébullition (i00-102o) que l’on mainlien.t pendant 00 beu-res environ. II se dégage de l’ammoniaque et un précipité abon-dant se forme. On filtre ensuite à cbaud, on lave le précipité (formé d’oxalate et de carbonate de baryum) à l’eau bouillante. ”